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EpiTect MethyLight PCR Kits

探针法定量real-time PCR分析甲基化状态

  • 基于TaqMan探针的real-time分析,准确度高
  • 配合MethyLight Assays,可靠进行甲基化定量检测
  • 方便的预混液形式,无需进一步优化

EpiTect MethyLight PCR Kit和EpiTect MethyLight PCR + ROX Vial Kit确保高灵敏度的可靠定量检测,使用TaqMan探针或双标探针以区分甲基化位点。该试剂盒为即用型试剂盒,无需进一步优化。该试剂盒与各种定量PCR仪兼容,EpiTect MethyLight PCR Kit适用于除Applied Biosystems 7500以外的所有Applied Biosystems的PCR仪。EpiTect MethyLight PCR +ROX Vial Kit适用于所有其他的PCR仪,包括Applied Biosystems 7500和Bio-Rad、Cepheid、Corbett、Eppendorf、Roche和Stratagene的仪器。

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Cat No./ID: 59436
EpiTect MethyLight PCR Kit (200)
Master Mix for methylation-specific real-time PCR analysis, 200 x 50 µl reactions
Cat No./ID: 59496
EpiTect MethyLight PCR +ROX Vial Kit (200)
Master Mix without ROX for methylation-specific real-time PCR analysis, 200 x 50 µl reactions

EpiTect MethyLight PCR Kits适用于分子生物学应用。该产品不适用于疾病的诊断、预防或治疗。


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Product Details

Performance
EpiTect MethyLight PCR Kit可灵敏检测DNA甲基化状态的微小变化(参见"Sensitive real-time PCR quantification"),需与双标分析配合使用,如预设计的EpiTect MethyLight Assays。
Principle

EpiTect MethyLight PCR Kits与EpiTect MethyLight Assays或其他双标探针-引物配合使用,可灵敏定量亚硫酸氢盐转化后DNA中的甲基化DNA。根据对于序列甲基化状态区分程度的要求,MethyLight可用于定量和半定量分析。

双标记探针,包括TaqMan探针,是序列特异性的寡聚核苷酸,带有荧光基团和淬灭基团。荧光基团在探针的5'末端,而淬灭基团通常在3'末端或中间。在PCR的延伸阶段,Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性水解探针,将荧光基团和淬灭基团分离。可检测的荧光量与扩增的PCR产物成正比。

特异性甲基化探针定量MethyLight real-time PCR产物

使用MethyLight PCR进行定量甲基化分析,含有不同荧光标签的两个双标探针与一组PCR引物配合使用。亚硫酸氢盐转化后DNA需要一个不同的探针,以区分甲基化和非甲基化CpG位点。这些引物特异性针对非甲基化位点。一个探针在某一位点与甲基化DNA特异性结合,而其他探针特异性结合同一位点的非甲基化DNA。不同的探针包含不同的荧光基团,由此定量甲基化和非甲基化序列(参见"Quantitative MethyLight real-time PCR")。

特异性甲基化探针半定量MethyLight real-time PCR产物

对于半定量MethyLight分析,一个双标探针与一组特异性结合某些甲基化位点的PCR引物配合使用。亚硫酸氢盐转化后DNA需要一个不同的探针,以区分甲基化和非甲基化CpG位点,这些引物要特异性结合甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA。如果甲基化特异性引物结合到DNA上,它会在延伸阶段加长,并且Taq DNA Ploymerase的5'→3'外切酶活性会引起引物降解,释放荧光基团。由于荧光基团与淬灭基团已经隔离,可检测到荧光(参见"Semiquantitative MethyLight real-time PCR")。

提高特异性

EpiTect MethyLight Master Mix专用于序列特异性探针法高灵敏地检测甲基化和非甲基化DNA。除各种盐类和添加剂,缓冲液含有经优化的KCl和(NH4)2SO4组合,提高每个PCR扩增退火过程特异性引物与探针结合的比例。可确保区别探针杂交和检测非甲基化和/或甲基化靶序列。严谨的引物退火条件可在亚硫酸氢盐转化后DNA扩增过程中提高PCR特异性,能够可靠的进行基于探针的甲基化状态检测。

MethyLight PCR的对照反应

为确保用于检测甲基化或非甲基化DNA的MethyLight PCR探针和引物具有特异性,需要进行对照反应。应用不同浓度的亚硫酸氢盐转化后对照DNA(完全甲基化和完全非甲基化)。此外,确定甲基化程度过程中可将这些对照DNA混合物作为定量分析标准。配合EpiTect Control DNA Set,QIAGEN以即用型试剂盒的形式提供所有的对照DNA,包括:甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA、非甲基化的亚硫酸氢盐转化后DNA和人类基因组DNA,用于可靠的、标准化的甲基化特异性对照反应。

Procedure

EpiTect MethyLight PCR Kit以预混液的形式提供,确保快速方便的反应体系构建。提供两种试剂盒,即预混液中添加ROX和未添加ROX,针对各种不同的real-time循环仪可灵活选择。经验证的操作流程适用于大部分real-time循环仪,确保最佳效果。

EpiTect MethyLight PCR Kit提供含有ROX参比染料的预混液,专为配合需要高浓度ROX染料进行荧光校准的real-time PCR仪进行了优化(如Applied Biosystems的仪器,除了Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems)。

EpiTect MethyLight PCR + ROX Vial Kit提供不含ROX染料的预混液,但提供单独包装的ROX染料,可根据real-time循环仪的要求加入反应体系。该试剂盒用于需要较低浓度ROX染料进行荧光校准的循环仪(如Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems),可选择性地使用需ROX染料的循环仪(如Stratagene的仪器),以及无需ROX染料的仪器。

表观遗传学中标准化的工作流程

生物学和医药研究的很多领域中,尤其是肿瘤学、干细胞研究和发育生物学研究中,获得表观遗传学信息是首要任务。但是,由于缺乏提供可重复性数据的标准化方法,尤其是样本材料的限制,分析DNA的甲基化变化非常困难。QIAGEN最新推出的EpiTect方案,建立了从DNA样本收集、稳定和纯化到亚硫酸氢盐转化和real-time或终点式PCR甲基化分析或测序的标准化预分析和分析方案(参见"Standardized workflows in epigenetics")。

Applications

EpiTect MethyLight PCR Kits适用于定量和半定量real-time PCR分析,可与EpiTect MethyLight Assays或其他双标探针-引物配合使用。

Specifications

Features
Specifications
应用 Quantification of bisulfite converted DNA
反应类型 Highly accurate and sensitive probe-based MethyLight real-time analysis
real-time或终点法PCR Real-time
样本/目标类型 Bisulfite converted DNA
单一或多重 Single & duplex
SYBR Green I或序列特异性探针 sequence-specific probes
热循环仪 Most real-time cyclers excepted Roche LightCycler®
有/无ROX Available with ROX in master mix and with ROX as separate vial

Product Resources

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